O núcleo do projeto do laboratório de PCR:
1, layout do laboratório de PCR
O laboratório de teste de amplificação por PCR está dividido em três áreas de trabalho separadas, em princípio: área de armazenamento e preparação de reagentes, área de preparação de amostras, área de amplificação e análise de produto de amplificação. Para evitar contaminação cruzada, a entrada em cada área de trabalho deve seguir estritamente uma única direção, ou seja, apenas a partir da área de armazenamento e preparação do reagente → área de preparação da amostra → área de amplificação e análise do produto de amplificação. A transferência de reagentes e amostras entre cada área experimental deve ser realizada através da janela de transferência.
2. Projeto de sistema de ar condicionado e ventilação de laboratório e controle de pressão
O laboratório de PCR não tem requisitos rígidos de nível de purificação, mas para evitar a possibilidade de contaminação cruzada entre várias áreas experimentais, é aconselhável adotar um formulário de entrega completa e organização de exaustão total do ar. Ao mesmo tempo, a proporção de suprimento de ar e exaustão deve ser estritamente controlada para garantir os requisitos de pressão de cada área experimental.
(1) Área de armazenamento e preparação de reagentes
As principais operações nesta área experimental são a preparação de reagentes de armazenamento, a dispensação de reagentes e a preparação da mistura de reação principal. Reagentes e materiais usados para preparação de amostras devem ser transportados diretamente para esta área e não através de outras áreas. As matérias-primas do reagente devem ser armazenadas nesta zona e preparadas com os reagentes de armazenamento necessários nesta zona. Para o controle da pressão do fluxo de ar, esta área deve manter uma leve pressão positiva externa.
(2) Área de preparação de amostra
As principais operações nesta área são a preservação de amostras, extração de ácido nucleico (RNA, DNA), armazenamento e adição ao tubo de reação de amplificação e medição da síntese de DNA. O gradiente de pressão nesta área deve ser uma pressão positiva em relação à área adjacente para evitar poluição por aerossol que entra na área vinda da área adjacente. Além disso, uma vez que a contaminação causada por aerossóis pode ocorrer durante as operações de carregamento de amostra, deve-se evitar caminhadas desnecessárias nesta área.
(3) Área de análise de produto de amplificação e amplificação
As principais operações nesta área são a amplificação de DNA e a determinação de fragmentos amplificados. Além disso, a adição do molde de DNA preparado (da área de preparação da amostra) e a preparação da mistura de reação principal (da área de armazenamento e preparação do reagente) em uma mistura de reação também pode ser realizada nesta área. Os requisitos de gradiente de pressão nesta área são: pressão negativa em relação à área adjacente para evitar vazamento de aerossol dessa área. Para evitar a poluição causada por aerossóis, caminhadas desnecessárias na área devem ser minimizadas. Operações individuais, como adição de amostra, devem ser realizadas em uma bancada ultralimpa.
3. Prevenção e controle da poluição
A questão central do projeto do laboratório de PCR é como evitar a contaminação. No trabalho real, os seguintes tipos de poluição são comuns: contaminação de produtos amplificados; contaminação do DNA genômico natural; contaminação de reagentes e contaminação entre amostras. Porque, uma vez que a poluição ocorra, o experimento deve ser interrompido até que a fonte da poluição seja encontrada, e o resultado do experimento deve ser invalidado e o experimento deve ser repetido. Portanto, é demorado e tedioso encontrar a fonte de poluição em torno do laboratório depois que a poluição ocorre, e desperdiçar mão de obra e recursos materiais. Portanto, para evitar a poluição, a primeira prioridade deve ser a prevenção, não a eliminação.
(1) Divisão estrita da área de trabalho
A configuração de cada área experimental é razoável; cada área experimental deve ter marcações óbvias (como número de casa atraente ou cor de fundo diferente, etc.) para evitar confusão de equipamentos e reagentes em diferentes áreas experimentais.
(2) Configurações de sistema razoáveis
Configurações razoáveis do sistema de ar condicionado e ventilação, tente usar sistemas de ar condicionado de entrega total e exaustão total; controle estrito da pressão do fluxo de ar para garantir diferentes requisitos de pressão em diferentes áreas experimentais.
(3) Operação padrão
Os técnicos do laboratório de testes de amplificação devem ser submetidos a treinamento em serviço, e somente após serem qualificados podem ser engajados em testes clínicos de amplificação gênica; durante a operação experimental, o operador deve usar luvas e trocá-las com frequência. Além disso, o uso de bonés descartáveis na operação também é uma medida eficaz de prevenção à poluição; o trabalho de limpeza é oportuno e correto. Após o término do trabalho experimental, a área deve ser limpa imediatamente. Além do líquido de desinfecção convencional para limpar e desinfetar a superfície ou desinfecção por irradiação de luz ultravioleta, alguns equipamentos experimentais também devem ser autoclavados.
(4) Gestão estrita
Controle estritamente o pessoal que entra e sai do laboratório. Pessoal que não tenha nada a ver com o experimento não pode entrar e sair do laboratório à vontade. Se possível, crie passagens e portas independentes para entrar e sair de toda a área experimental; minimizar caminhadas desnecessárias na área experimental para reduzir a possibilidade de contaminação cruzada; produtos de amplificação A área de análise é a principal fonte de contaminação dos produtos amplificados. O líquido residual não pode ser despejado no laboratório. Deve ser embebido e desinfetado com um desinfetante e descartado fora do laboratório. Materiais descartáveis, como pontas usadas, também devem ser desinfetados. Após imersão e desinfecção, tratamento uniforme, como incineração, etc .; a área de análise de produto de amplificação pode usar algumas mutações genéticas e substâncias tóxicas, e atenção especial deve ser dada à proteção de segurança do pessoal do experimento.
(5) Instalações laboratoriais de apoio completas
Instalações laboratoriais de apoio completas são necessárias para garantir o trabalho experimental. Os equipamentos e instrumentos correspondentes devem ser equipados de acordo com os diferentes conteúdos experimentais de cada laboratório, como bancadas ultra-limpas, centrífugas, amostradores, etc.