Para evitar a contaminação cruzada durante a operação, os principais requisitos para o gerenciamento de projeto, construção e operação são:
1. O projeto e a construção do laboratório, o sistema de trabalho seguro ou os procedimentos operacionais padrão de segurança devem atender aos requisitos do&atual: Requisitos Gerais para Biossegurança em Laboratório GG; GB19489.
2. A PCR é dividida em quatro áreas funcionais de acordo com as etapas de trabalho, a saber, área de armazenamento e preparação de reagentes, área de preparação de amostras, área de amplificação e área de análise de produtos de amplificação. Se um instrumento de PCR fluorescente em tempo real estiver equipado, as áreas de amplificação e análise do produto podem ser combinadas. Cada área funcional deve estar claramente marcada, e equipamentos e artigos em diferentes áreas funcionais não devem ser misturados.
A direção do fluxo de ar do laboratório de PCR pode ser realizada de acordo com a área de armazenamento e preparação de reagentes → área de preparação de amostras → área de amplificação → área de análise amplificada do produto para impedir que os produtos amplificados entrem na área pré-amplificada junto com o fluxo de ar. Pode ser realizada de maneira a diminuir a pressão do ar da área de armazenamento e preparação de reagentes → área de preparação de amostras → área de amplificação → área de análise do produto de amplificação. Isso pode ser conseguido com a instalação de exaustores, dispositivos de exaustão com pressão negativa ou outros métodos viáveis.
3. A entrada em cada área de trabalho deve seguir estritamente uma única direção, ou seja, área de armazenamento e preparação de reagentes → área de preparação de amostras → área de amplificação → área de análise do produto de amplificação. Áreas de trabalho diferentes (como cores diferentes) devem ser usadas. Os trabalhadores não devem tirar roupas de trabalho quando deixarem cada área de trabalho.
4. A limpeza do laboratório deve ser realizada na direção da área de armazenamento e preparação de reagentes → área de preparação de amostras → área de amplificação → área de análise amplificada do produto. Diferentes áreas experimentais devem ter seus próprios aparelhos de limpeza para evitar contaminação cruzada.
5. Após o término do trabalho, a área de trabalho deve ser limpa imediatamente. A superfície da bancada do laboratório na área de trabalho deve ser capaz de suportar os efeitos de desinfecção e limpeza de produtos químicos, como o hipoclorito de sódio. A irradiação ultravioleta na superfície da bancada do laboratório deve ser conveniente e eficaz. Como a distância e a energia da irradiação ultravioleta são muito críticas para o efeito de descontaminação, uma lâmpada ultravioleta móvel (comprimento de onda de 254nm) pode ser usada e, após o término do trabalho, ela pode ser ajustada para irradiar entre 60-90cm na mesa experimental . Uma vez que o produto amplificado é apenas algumas centenas ou dezenas de pares de bases (bp), não é sensível a danos por UV, portanto o fragmento amplificado irradiado por UV deve ser irradiado por mais tempo, preferencialmente durante a noite.
As funções da área de armazenamento e preparação de reagentes são: a preparação de reagentes de armazenamento, a distribuição de reagentes e a preparação da mistura de reação de amplificação, bem como o armazenamento e a preparação de consumíveis, como tubos e pontas de centrifugação. Materiais como reagentes de armazenamento e consumíveis usados para a preparação de amostras devem ser transportados diretamente para a área de armazenamento e preparação de reagentes e não podem passar pela área de detecção de amplificação. Os materiais de controle positivo e de controle de qualidade no kit não devem ser armazenados nesta área, mas devem ser armazenados nessa área. Área de processamento de amostras.
A função da área de preparação de amostras é: extração, armazenamento e adição de ácido nucleico (RNA, DNA) ao tubo de reação de amplificação. Para operações envolvendo amostras clínicas, os requisitos de equipamento de proteção, proteção individual e especificações operacionais para laboratórios secundários de biossegurança devem ser atendidos. Como a contaminação por aerossóis pode ocorrer durante a mistura de amostras e a purificação de ácidos nucléicos, condições de pressão positiva podem ser estabelecidas nessa área para evitar a contaminação por aerossóis de áreas vizinhas. Para evitar a contaminação cruzada entre as amostras, após a adição do ácido nucleico a ser testado, o tubo de reação que contém a mistura de reação deve ser coberto. Para materiais potencialmente infecciosos, a tampa deve ser aberta no gabinete de segurança biológica e deve haver procedimentos claros para manuseio e inativação de amostras.
A função da zona de amplificação é: síntese de DNA, amplificação e detecção de DNA. Para evitar a poluição causada por aerossóis, a caminhada na área deve ser minimizada. Deve-se notar que todos os tubos de reação testados não devem ser abertos nesta área.
A função da área de análise de produto amplificada é: análise e determinação de fragmentos amplificados, como hibridação, eletroforese de digestão enzimática, desnaturação de análises líquidas de alto desempenho, sequenciamento, etc. em membranas ou microplacas ou chips (rotulagem de radionuclídeos ou rotulagem não radioativa de nuclídeos), eletroforese em gel de agarose direta ou digerida, eletroforese em gel de poliacrilamida, transferência Southern, métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos, espectrometria de massa, etc.
A área de análise do produto de amplificação é a principal fonte de contaminação do produto de amplificação no laboratório de PCR, portanto, deve-se tomar cuidado para evitar transportar o produto de amplificação pelos artigos e roupas de trabalho nessa área. Ao usar o método PCR-ELISA para detectar produtos amplificados, uma lavadora de placas deve ser usada para lavar as placas e o líquido residual deve ser coletado em 1 mol / L de HCl e não pode ser derramado em laboratório, mas deve ser descartado do laboratório de PCR. Solta. A ponta usada também deve ser embebida em 1 mol / L de HCl e depois colocada em um saco de lixo para descarte de acordo com procedimentos, como a incineração. Como essa área pode usar certas mutações genéticas e substâncias tóxicas, como brometo de etídio, acrilamida, formaldeído ou radionuclídeos, etc., deve-se prestar atenção à proteção de segurança dos pesquisadores.